El nitrógeno es un elemento que los seres vivos necesitan para fabricar proteínas y ADN. Las plantas y los animales no pueden tomarlo directamente del aire o del suelo: dependen de bacterias que lo convierten en formas que sí pueden absorber y luego lo devuelven a la atmósfera o al suelo.
Una de esas bacterias utiliza una enzima llamada nitrito reductasa de cobre (CuNiR) para transformar el nitrito en óxido nítrico, un paso dentro de ese circuito.
Por décadas, se sabía que existía pero no podían ver cómo funcionaba por dentro con suficiente detalle. Sin embargo, científicos del Reino Unido, Argentina y Japón lo consiguieron.
“Logramos algo así como un cortometraje sobre la enzima átomo por átomo en varios estados de funcionamiento, algo que no se había conseguido antes para el sistema que estudiamos en particular», dijo a Infobae el licenciado en biotecnología y doctor en biología Felix Ferroni, investigador independiente del Conicet y la Universidad Nacional del Litoral en la Argentina.
El científico argentino formó parte del equipo con Samuel Rose, Svetlana Antonyuk y Samar Hasnain de la Universidad de Liverpool, Reino Unido, y Masaki Yamamoto y Takehiko Tosha junto con otros colaboradores del Centro RIKEN SPring-8 y la Universidad de Hyogo en Japón. Publicaron los resultados en la revista Nature Communications
El hallazgo confirmó con una precisión sin precedentes el orden de los eventos que disparan la reacción química dentro de la enzima.
“Saber que el nitrito llega antes que el electrón permite entender con exactitud cómo controlar esa reacción, lo que abre la puerta a diseñar inhibidores o modificaciones enzimáticas con aplicaciones en agricultura, medicina y control ambiental», dijo el científico Ferroni, en diálogo con Infobae.
Se trata de una investigación de ciencia básica, que funciona como un “manual de instrucciones de una máquina” que antes solo se podía operar a ciegas.
La enzima que nadie había podido ver de cerca
La enzima NirK tiene dos centros de cobre en su interior: el primero capta electrones del exterior y los pasa al segundo, donde ocurre la reacción con el nitrito.
La gran pregunta era si el nitrito llegaba a ese segundo centro antes o después del electrón, y los estudios previos solo habían podido dar respuestas parciales.
El motivo era técnico: las fuentes de rayos X convencionales alteraban químicamente la enzima durante la medición, un fenómeno llamado fotorreducción que modificaba su estado y contaminaba los resultados.
Los investigadores del Reino Unido, Argentina y Japón se propusieron obtener imágenes limpias en cuatro estados distintos de la enzima: con acidez baja y alta, reducida y con nitrito acoplado.
La acidez, medida en una escala llamada pH, afecta directamente qué tan rápido trabaja la enzima. Su actividad alcanza el punto máximo alrededor de un pH de entre 5,5 y 6,0, y cae tanto si el entorno se vuelve más ácido como si se vuelve más alcalino.
La comprensión de este mecanismo no es solo una curiosidad científica: podría ayudar a diseñar estrategias para reducir emisiones de gases de efecto invernadero o mejorar el uso del nitrógeno en suelos agrícolas, donde el exceso de este elemento contamina napas y ríos.
Pulsos de luz más rápidos que el daño
Para esquivar la fotorreducción, los investigadores usaron el láser de electrones libres de rayos X —conocido como XFEL— del laboratorio SACLA, en Japón.
Este dispositivo dispara pulsos de rayos X de menos de diez Femtosegundos, un tiempo tan corto que la imagen queda capturada antes de que la radiación altere químicamente la muestra. Un femtosegundo equivale a una milbillonésima de segundo.
“Se prepararon entre 42 y 64 cristales de las enzimas de las bacterias Bradyrhizobium sp. ORS 375, Bradyrhizobium japonicum y Achromobacter cycloclastes, a temperaturas del nitrógeno líquido a 196 grados centígrados bajo cero“, precisó el científico.
El refinamiento de las estructuras se realizó con el programa SHELXL, que permitió medir distancias entre átomos con una precisión de centésimas de Angström (una unidad que equivale a la diez millonésima parte de un milímetro).
Lo que encontraron dentro de la enzima
Las estructuras mostraron que el sitio activo —el lugar donde ocurre la reacción— tiene, en reposo, dos moléculas de agua junto a tres aminoácidos llamados histidinas, formando cinco puntos de anclaje alrededor del cobre.
Esa misma arquitectura apareció en las tres especies analizadas, lo que resolvió una discrepancia que venía arrastrándose entre estudios anteriores.
Cuando el nitrito llega, desplaza las dos moléculas de agua pero la geometría de cinco puntos se mantiene porque el nitrito se une por dos extremos a la vez.
La investigación confirmó que ese acoplamiento ocurre antes de que el electrón llegue, en una disposición que los investigadores llamaron “top-hat” (como la copa de un sombrero) y que resultó ser la forma inicial de unión.
En el estado reducido —cuando la enzima ya recibió el electrón—, el sitio activo perdió las moléculas de agua y quedó con solo tres puntos de anclaje, con un aminoácido llamado isoleucina ocupando el espacio vacante.
En las especies de bacterias Bradyrhizobium, cuya transferencia de electrones es más lenta que en Achromobacter, esa lentitud permitió capturar estados intermedios que en la enzima más activa se suceden demasiado rápido para ser registrados.
Lo que falta y lo que se viene
Los científicos reconocieron que trabajar a temperaturas criogénicas puede no reflejar con exactitud lo que pasa en el suelo real, donde la temperatura y el movimiento molecular son muy distintos.
El doctor Ferroni explicó a Infobae el criterio detrás de esa decisión: “Se utilizan temperaturas criogénicas para evitar el daño por radiación. Si bien trabajar a temperaturas ambiente daría información estructural relevante, estas estructuras estarían más expuestas a fenómenos de daño por radiólisis e indirectamente modificarían la arquitectura de los centros activos”.
El investigador agregó que el objetivo fue “preservar los sitios y evaluar los estados de oxidación de los centros metálicos y la protonación de los residuos clave en la catálisis”. El volumen de cristales necesario también limita por ahora aplicar el método a otras proteínas más difíciles de cristalizar.
Los investigadores señalaron que el paso siguiente sería llevar el enfoque a temperatura ambiente, aunque advirtieron que el daño por radiación sería mayor en esas condiciones y requeriría un estudio previo.
Si ese desafío se resuelve, el mismo método podría aplicarse a otras metaloenzimas (que son enzimas que contienen metales en su estructura) para obtener imágenes igual de precisas y libres de interferencia.
De acuerdo con Ferroni, “las aplicaciones potenciales de los resultados de nuestro trabajo serían dos. Una de ellas es que se podría contar con una metodología afinada para el estudio de otras metaloenzimas. Otros usos posibles serían el monitoreo ambiental y el tratamiento de efluentes”.
El científico agregó: “Tras los resultados del trabajo publicado en Nature Communications, ya seguimos haciendo más estudios. Uno de mis becarios es Joaquín Puchol, quien se encuentra en Hamburgo, Alemania en una colaboración para seguir develando el funcionamiento de los sistemas CuNirs. También la becaria Cintia Ramírez trabaja con la enzima proveniente de Bradyrhizobium japonicum”.
